基因毒杂质肼的限度及检测方法

l 简介

水合肼是一种常用的医药中间体，可作为还原剂，参与多种不同类型的药物的合成。由于反应过程中副产物只产生氮气和水，所以水合肼是一种绿色还原剂，工业应用极其常见。

l 毒性

肼在体内和体外均具有致突变性和遗传毒性。

肼被IARC列为2B类，对人类可能致癌（参考文献6）。EPA认为肼是B2类致癌物或人类可能的致癌物质（参考文献7）。

CPBD引用了7项关于肼的致癌性研究（参考文献8）：其中3项采取吸入给药1年，3项采取饮水给药，还有1项采取灌胃给药。7项肼致癌性研究中，有5项研究报告认为肼具有致癌性。

国内外药典中有多个原料药把肼残留列入杂质检查项中如异烟肼、氯沙坦钾、硫酸双肼屈嗪、别嘌呤醇、肼屈嗪、呋喃西林、盐酸肼苯哒嗪、卡比多巴、吡哆醛异烟腙。

l 限度

ICHM7给出了肼的口服及吸入的可接受限度

口服限度：

终生AI = TD50/50,000 × 50 kg

终生AI = 38.7 (mg/kg/天)/50,000 × 50 kg

终生AI = 39 μg/天

吸入限度：

终生AI = TD50/50,000 × 50 kg

终生AI = 0.194 (mg/kg/天)/50,000 × 50 kg

终生AI = 0.2 μg/天

在药品中的限度在ppm级别，因此对该杂质的分析方法灵敏度也提出了很高的要求。

l 分析方法

对于水合肼的检测方法国内外都有过相关研究，包括TLC、GC、HPLC以及离子色谱等。

肼虽然结构简单，但极性强在液相色谱柱中几乎不保留，且没有紫外吸收，因此很难通过高效液相色谱直接检测，需进行衍生化改变其极性和增强在检测器中的响应，达到定量分析的目的。常用的衍生试剂有苯甲醛、乙酰丙酮、丙酮、糠醛、对二甲氨基苯甲醛等。

衍生原理：利用醛、酮易于和肼缩合生成腙的原理，采用各种醛、酮作为衍生试剂，反应式见图1。

l 英国药典异烟肼中游离肼分析方法-苯甲醛衍生法

色谱条件

色谱柱：l= 0.25 m，? = 4.6 mm；固定相：用于色谱（5 μm） 的封端十八烷基硅烷基硅胶。

流动相：水-乙腈（40∶60）。

流速：1.0 mL/min。

波长：300 nm。

进样量：10 μL。

运行时间：苯甲醛腙保留时间的 1.5 倍。

限度：15 ppm。

对于某些产品因日用量较大，限度更低如1ppm以下，常规的HPLC方法的灵敏度无法满足，这时就需要用更高灵敏度的液质联用或气质联用仪来进行肼残留的分析。

另外还有采用衍生后紫外或荧光分光光度计方法进行肼的检测。荧光方法以2-羟基-1-萘醛作为衍生剂，和肼形成DHND衍生物（见图2），它是直接分析前提取到氯仿中。该方法在10-160ppb范围内成，检测限可达3.2ppb。

我院基因毒杂质研究中心有多个原料药及制剂品种的肼残留分析方法研究经验，先后开发了液相、液质、气质等多种肼残留的分析方法，这些方法均在文献方法基础上优化了衍生条件、色谱条件，增强了方法的耐用性和准确度，并进行了充分的方法验证，证明了方法的科学性。