肉苁蓉含量测定方法验证

肉苁蓉含量测定方法验证

1 范围
本方法适用于中药材及其中药饮片中含量的测定。
2 规范性文件
本方法依据《中国药典》2015版四部通则0512
3 原理
采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4 试剂和材料
4.1 甲酸：分析纯。
4.2 甲醇：色谱纯。
4.3 0.1%甲酸溶液：量取甲酸1.0mL用水定容到1000mL。
4.4 松果菊苷（中国食品药品检定研究院    批号：111670-201706）。
4.5毛蕊花糖苷（中国食品药品检定研究院    批号：111530-201713）。
5 仪器和设备
5.1高效液相色谱仪
5.2色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（C18,250mm×4.6mm，5μm）
5.3流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B）（梯度洗脱）

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
0-17	26.5	73.5
17-20	26.5-29.5	73.5-70.5
20-27	29.5	70.5

5.4检测波长：330nm
5.5柱温：25℃
6  试样处理
称取样品粉末（过四号筛）约1.0g，精密称定，置100mL棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，摇匀，称定重量，浸泡30min，超声处理（功率250W，频率35KHz）40min ,放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
7  标准曲线绘制
7.1 标准曲线绘制：
松果菊苷标准储备液：950.0μg/mL。
毛蕊花糖苷标准储备液：1009.0μg/mL
标准使用液：吸取松果菊苷，毛蕊花糖苷标准储备液于10mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度。稀释成松果菊苷浓度4.75μg/ml、9.5μg/ml、23.75μg/ml、47.5μg/ml、95.0μg/ml、237.5μg/ml、475.0μg/ml、950.0μg/ml标准使用液和毛蕊花糖苷浓度5.045μg/ml,10.09μg/ml,25.225μg/ml,50.45μg/ml,100.9μg/ml,252.25μg/ml,504.5μg/ml，,1009.0μg/ml标准使用液。
8、结果处理
试样松果菊苷，毛蕊花糖苷含量按下式进行计算：

X(%)=	C×V×f×100
	m×1000×1000

式中:X-试样中松果菊苷，毛蕊花糖苷含量,单位为百分之(%);
C-由标准曲线得出松果菊苷，毛蕊花糖苷的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
m-试样质量,单位为克(g);
V-试样的最终定容体积,单位为毫升(mL)。
9、验证结果
1.线性结果
A.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
毛蕊花糖苷  Y=6421.45*X-34072.1    R^2=0.9996350

表1 毛蕊花糖苷标准系列试验结果

C（μg/mL）	5.045	10.09	25.225	50.45	100.9	252.25	504.5	1009.0
A	37546	68673	117658	300638	604254	1546034	3128754	6493599

  以上结果表明毛蕊花糖苷在5.045μg/mL ~1009.0μg/mL范围内，R=0.9998175,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
B.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
松果菊苷  Y=11280.5*X-4686.25    R^2= 0.9999800

C（μg/mL）	4.75	9.5	23.75	47.5	95.0	237.5	475.0	950.0
A	59668	103253	269389	528208	1033552	2679041	5377342	10702002

以上结果表明松果菊苷在4.75μg/mL ~950.0μg/mL范围内，R=0.9999900,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
A.将5.45μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出毛蕊花糖苷的方法检出限为0.0006%，此检出限结果满足条件。

B.将4.75μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出松果菊苷的方法检出限为0.00045%，此检出限结果满足条件

10、重复性测定
A.对样品JF180401230进行8次进样，其毛蕊花糖苷测试值如下表所示：

编号	质量（g）	浓度（μg/ml）	含量(%)	平均含量(%)	RSD(%)
1	1.0017	204.720	1.02	1.02	0.35
2	1.0021	204.631	1.02
3	1.0032	204.549	1.02
4	1.0067	204.379	1.02
5	1.0061	204.196	1.01
6	1.0057	204.265	1.02
7	1.0108	204.418	1.01
8	1.0055	204.355	1.02

本方法的精密度为0.35%，，符合《中国药典》2015版中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
B.对样品JF180401230进行8次进样，其松果菊苷测试值如下表所示：

编号	质量（g）	浓度（μg/ml）	含量(%)	平均含量(%)	RSD(%)
1	1.0017	677.740	3.38	3.37	0.30
2	1.0021	677.031	3.38
3	1.0032	677.556	3.38
4	1.0067	677.186	3.36
5	1.0061	677.952	3.37
6	1.0057	677.323	3.37
7	1.0108	677.255	3.35
8	1.0055	677.459	3.37

本方法的精密度为0.30%，，符合《中国药典》2015版中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
11、准确度验证（加标回收）
A.对样品JF180401230加标，取毛蕊花糖苷浓度1009.0 μg/mL的标液0.22 mL、0.65ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		毛蕊花糖苷
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	含量（%）	平均值（%）	加标量（%）	回收率%
1#	1.0031	50.0	204.803	1.02	1.02	/	/
2#	1.0042	50.0	204.19	1.02		/	/
加标1#	1.0026	50.0	208.173	1.04	/	0.022	90.9
加标2#	1.0053	50.0	216.309	1.08	/	0.065	92.3

由上表可以看出毛蕊花糖苷测定的加标回收范围在90.9%-92.3% ，RSD值为1.08%符合规定要求。
B.对样品JF180401230加标，取松果菊苷浓度950.0 μg/mL的标液0.22 mL、0.65 mL同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		松果菊苷
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	含量（%）	平均值（%）	加标量（%）	回收率%
1#	1.0031	50.0	677.695	3.38	3.38	/	/
2#	1.0042	50.0	677.488	3.37		/	/
加标1#	1.0026	50.0	681.141	3.40	/	0.021	95.2
加标2#	1.0053	50.0	690.681	3.44	/	0.061	98.4

由上表可以看出松果菊苷测定的加标回收范围在 95.2%-98.4% ，RSD值为2.21%符合规定要求。
12、专属性
对样品和阴性对照样品进行同样的方法处理，在同样的条件下上机，得出如下图谱所示：

 

   

            阴性对照样品图谱  样品图谱
通过对样品和阴性对照样品的上机比较，此方法符合要求。

13、耐用性
柱温：30℃
通过对液相高效色谱仪柱温的改变，其他条件不变的环境下对样品进行上机，结果变化，如图

 

        温度改变后温度改变前
14、总结.
本方法从检出限、线性范围、重复性、回收率、专属性、耐用性进行测试，测试结果可知，均符合方法要求，本实验方法符合《中国药典》2015版要求。

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