一次性使用卫生用品卫生标准产品微生物的检测

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一次性使用卫生用品卫生标准产品微生物的检测

GB 15979-2002（附录B）

西安国联质量检测技术股份有限公司

化工室：张苗苗

一、方法概述
1.1 细菌菌落总数与初始污染菌检测：将处理的检样自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种5个平1.2 大肠菌群检测：将处理的检样取样液5mL,接种50mL乳糖胆盐发酵管，置35℃±2℃培养24h后，如不皿，每个平皿中加入1mL样液，用融化的营养琼脂倒入每个平皿内混匀，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48h后，计算平板上的菌落数。
产酸产气，则报告为大肠菌群阴性。如产酸产气，则接种伊红美蓝平板，如有典型大肠菌落，进行鉴定。
1.3 绿脓杆菌检测：将处理的检样取样液5mL,接种50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18～24h，如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现薄菌膜，培养液呈现黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，置35℃±2℃培养18～24h，观察菌落特征，如有特征菌落，进行鉴定。
1.4 金黄色葡萄球菌检测：将处理的检样取样液5mL,接种50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18～24h，自上述培养中取1～2接种环，划线接种置血琼脂培养基上，置35℃±2℃培养18～24h，观察菌落特征，如有特征菌落，进行鉴定。
1.5 溶血性链球菌检测：将处理的检样取样液5mL,接种50mL葡萄糖肉汤，置35℃±2℃培养18～24h，将培养物划线接种置血琼脂平板，35℃±2℃培养24h，观察菌落特征，如有特征菌落，进行鉴定。
1.6 真菌菌落总数检测：将处理的检样自然沉降后取上清液作真菌菌落计数。共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL样液，用沙氏琼脂培养基倒入每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃培养7d后，分别于3﹑5﹑7天观察，计算平板上的菌落数，如有发现菌落蔓延，以前一次的菌落计数为准。
1.7 真菌定性检测：将处理的检样取样液5mL,接种50mL沙氏培养基中，25℃±2℃培养7天，逐日观察有无真菌生长。培养管浑浊应转钟沙氏琼脂培养基。
二、仪器与试剂
2.1 细菌菌落总数与初始污染菌检测
仪器：电子天平、恒温水浴锅、电热恒温培养箱、无菌平皿、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、营养琼脂培养基
2.2 大肠菌群检测
仪器：电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、乳糖胆盐发酵管、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝平板、革兰氏染液
2.3绿脓杆菌检测：
仪器：电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、SCDLP培养基、十六烷基三甲基溴化铵平板、革兰氏染液、氧化酶纸片、绿脓菌素培养基、三氯甲烷、盐酸、硝酸盐蛋白胨水培养基、明胶培养基、营养琼脂斜面
2.4金黄色葡萄球菌检测：
仪器：电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、SCDLP培养基、血平板、革兰氏染液
、甘露醇培养液、兔血浆
2.5溶血性链球菌检测：
仪器：电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、葡萄糖肉汤、血平板、革兰氏染液
、草酸钾血浆、氯化钙、每片含0.04单位杆菌肽的纸片
2.6 真菌菌落总数检测：
仪器：电子天平、恒温水浴锅、无菌平皿、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、霉菌培养箱
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、沙氏培琼脂养基
2.7 真菌定性检测：
仪器：电子天平、恒温水浴锅、无菌平皿、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、霉菌培养箱
试剂：生理盐水（浓度为0.85%）、沙氏脂养基、沙氏培琼脂养基
三、样品的采集与保存
与同一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品，1/4样品用于检测，1/4样品用于留样，另1/2样品（可就地封存）必要时用于复检。抽样的最小销售包装不应有破裂，检验前不得启开。
四﹑ 分析步骤
样品制备：在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品。剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。
4.1细菌菌落总数与初始污染菌检测
样品对照组：上述生理盐水样液自然沉降后取上清液。
试验组：取上述生理盐水样液自然沉降后取上清液9mL，加入1mL含有小于1000cfu/mL含有菌落的制样。
菌液组：制备100cfu/mL菌液。
各组共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15～20mL倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置36℃培养48h，计算平板上的菌落数。
4.2大肠菌群检测
样品对照组：取样液5mL
试验组：取样液5mL接入大肠杆菌菌株
菌液组：加入大肠杆菌菌株
各试验组接种50mL乳糖胆盐发酵管，置36℃培养24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。
如产酸产气，则划线接种伊红美蓝平板，置36℃培养24h,观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。
取疑似菌落1～2个作革兰氏镜检，同时接种乳糖发酵管，置36℃培养24h,观察产气情况。
4.3绿脓杆菌检测
样品对照组：取样液5mL
试验组：取样液5mL接入绿脓杆菌菌株
菌液组：加入绿脓杆菌菌株
加入到50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置36℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液长呈现黄绿色或者蓝绿色。从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种至十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，36℃培养18～24h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。
取可疑菌落涂片作革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行下列试验：
氧化酶试验：30S内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色为阴性。
绿脓菌素试验：取可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定培养基斜面，36℃培养24h，加入三氯甲烷3～5mL，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色即为阳性，表示有绿脓杆菌存在。
硝酸盐还原产气试验：挑取被检菌落纯培养物接种在硝酸盐蛋白胨水中，置36℃培养24h，培养基小倒管中有气者即为阳性。
明胶液化试验：取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36℃培养24h，取出放与4～10℃，如仍呈现液态为阳性，凝固者为阴性。
42℃生长试验：取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面上，置42℃培养24～48h,有绿脓杆菌生长为阳性。
4.4金黄色葡萄球菌检测
样品对照组：取样液5mL
试验组：取样液5mL接入金黄色葡萄球菌菌株
菌液组：加入金黄色葡萄球菌菌株
加入到50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置36℃培养24h。
取上述增菌液中1～2环，划线接种在血琼脂培养基上，置36℃培养24～48h。在血平板上该菌菌落呈金黄色，大而凸起，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。
挑取典型菌落，涂片作革兰氏染色镜检， 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽孢与荚膜。镜检符合上述情况，应进行下列试验：
甘露醇发酵试验：取上述菌落接种甘露醇培养液，置36℃培养24h,发酵甘露醇产酸者为阳性。
血浆凝固酶试验：玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑取菌落分别于生理盐水和血浆混合，5min如出现团状或颗粒状凝块，而盐水滴仍均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴和血浆均有凝固现象，在进行试管凝固酶试验;试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5mL，放灭菌小试管中，加入等量待检菌24h肉汤培养物0.5mL。混匀，放36℃温箱，每半小时观察一次，24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5mL作为阳性和阴性对照。
4.5溶血性链球菌检测
样品对照组：取样液5mL
试验组：取样液5mL接入溶血性链球菌菌株
菌液组：加入溶血性链球菌菌株
加入到50mL葡萄糖肉汤，36℃培养24h。
将培养物划线接种血琼脂平板，36℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在平板上为灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无透明溶血圈。
挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检，应为革兰氏阳性，呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况，应进行下列试验：
链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2mL，加入0.8mL灭菌生理盐水，混合后再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL，混匀，放36℃水浴中，2min观察一次，待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2h内不熔化，继续放置24h观察，如凝块全部熔化为阳性，24h仍不熔化为阴性。
杆菌肽敏感试验：将被检菌菌落涂于血平板上，用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板上，同时以已知阳性菌株作对照，在36℃放置18～24，有抑菌带者为阳性。
4.6真菌菌落总数检测
样品对照组：上述生理盐水样液自然沉降后取上清液。
试验组：取上述生理盐水样液自然沉降后取上清液9mL，加入1mL含有小于1000cfu/mL含有白色念珠菌菌落的制样
菌液组：制备100cfu/mL白色念珠菌菌液
各组检样共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基15～20mL倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置27℃培养7天，分别于3、5、7天观察，计算平板上的菌落数，如发现菌落蔓延，以前一次的菌落计数为准。
4.7真菌定性检测
样品对照组：取样液5mL
试验组：取样液5mL接入白色念珠菌菌株
菌液组：加入白色念珠菌菌株
加入到50mL沙氏培养基中，27℃培养7天，逐日观察有无真菌生长。培养管混浊应转钟沙氏琼脂培养基，证实有真菌生长。
五、试验结果
5.1细菌菌落总数和初始污染菌

菌落数cfu/g	样品对照组	试验组	菌液组
1	<20	98	96
2	<20	96	95
3	<20	99	97
4	<20	96	98
5	<20	97	94

5.2大肠菌群

试验项	样品对照组	试验组	菌液组
乳糖胆盐发酵管产酸产气	无	产酸产气	产酸产气
伊红美蓝平板有无典型菌落	/	有	有
革兰氏染色镜检	/	革兰氏阴性无芽孢杆菌	革兰氏阴性无芽孢杆菌
乳糖胆盐发酵管复发酵产酸产气	/	产酸产气	产酸产气

5.3绿脓杆菌

试验项	样品对照组	试验组	菌液组
培养液有无呈现薄菌膜	无	有	有
十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板有无典型菌落	/	有	有
革兰氏染色镜检	/	革兰氏阴性菌	革兰氏阴性菌
氧化酶试验	/	阳性	阳性
绿脓菌素试验	/	阳性	阳性
硝酸盐还原产气试验	/	阳性	阳性
明胶液化试验	/	阳性	阳性
42℃生长试验	/	阳性	阳性

5.4金黄色葡萄球菌

试验项	样品对照组	试验组	菌液组
血平板有无典型菌落	无	有	有
革兰氏染色镜检	/	革兰氏阳性球菌，葡萄状，无芽孢与荚膜	革兰氏阳性球菌，葡萄状，无芽孢与荚膜
甘露醇发酵试验	/	阳性	阳性
血浆凝固酶试验	阴性	阳性	阳性

5.5溶血性链球菌

试验项	样品对照组	试验组	菌液组
血平板有无典型菌落	无	有	有
革兰氏染色镜检	/	革兰式阳性，呈链状排列的球菌	革兰式阳性，呈链状排列的球菌
链激酶试验	/	阳性	阳性
杆菌肽敏感试验	/	阳性	阳性

5.6真菌菌落总数

菌落数cfu/g	样品对照组	试验组	菌液组
1	<20	102	103
2	<20	96	105
3	<20	99	100
4	<20	101	104
5	<20	102	99

5.7真菌定性

试验项	样品对照组	试验组	菌液组
沙氏培养液有无混浊	无	有	有
沙氏琼脂培养基有无真菌生长	无	有	有

六、方法准确性
6.1细菌菌落总数
回收率=试验组/菌液组*100
=（98+96+99+96+97）/(96+95+97+98+94)*100
=486/480*100=101.25
回收率为101.25大于70%，所做试验符合要求。
6.2大肠菌群
样品对照组未检出，试验组与菌液组均检出大肠菌群，符合要求。
6.3绿脓杆菌
样品对照组未检出，试验组与菌液组均检出绿脓杆菌，符合要求。
6.4金黄色葡萄球菌
样品对照组未检出，试验组与菌液组均检出金黄色葡萄球菌，符合要求。
6.5溶血性链球菌
样品对照组未检出，试验组与菌液组均检出溶血性链球菌，符合要求。
6.6真菌菌落总数
回收率=试验组/菌液组*100
      =（102+96+99+101+102）/(103+105+100+104+99)*100
      =500/511=97.85
回收率为97.85大于70%，所做试验符合要求。
6.7真菌定性
样品对照组未检出，试验组与菌液组均检出真菌，符合要求。
九、总结
      通过对整体确认，本次验证结果符合GB 15979-2002中的要求，因此用该标准方法测定一次性使用卫生用品中细菌菌落总数、大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、真菌菌落总数、真菌定性的结果是准确的，可靠的。