助力DNA测序：Aerolysin单分子界面灵敏识别DNA单碱基差异（《分析测试学报》精选论文20190202）

纳米孔道单分子电化学技术根据单个待测物分子穿过纳米孔道时造成的离子流阻断时间和程度差异，可在单分子水平实时获取待测物分子的结构、电荷、尺寸等信息。Aerolysin蛋白纳米通道是一种来自嗜水气单胞菌属的β-成孔毒素，其单体在水溶液中能够自发地聚合成七聚体，形成蘑菇状单个跨膜孔道蛋白界面，用于单分子分析研究。自发现Aerolysin蛋白孔道对单个核酸分子的高灵敏检测能力后，其高电化学空间限域能力已被用于多肽、蛋白质、核酸等生物分子的研究。

在前期研究基础上(Chem. Sci., 2019, 10, 354; Anal. Chem., 2018, 90, 7790;  Anal. Chem., 2018, 90, 4268），华东理工大学应佚伦副研究员课题组基于单个Aerolysin纳米孔道在无需标记、无需扩增的条件下可直接分辨3种具有单个碱基差异的单链DNA，以寡聚核苷酸Poly(dA)5为模板，在其中间位点引入炔基衍生物线性侧链从而设计了单碱基位点变异的寡聚核苷酸Poly(dA)4-alkynyl，通过引入炔基衍生物线性侧链后其相对分子质量相较Poly(dA)4增加251.1，相对分子质量增幅小于1个腺嘌呤核苷酸。进一步设计结构差异1个腺嘌呤核苷酸的Poly(dA)4与Poly(dA)5、Poly(dA)4-alkynyl进行对照实验，以研究单个碱基修饰对Aerolysin纳米孔道特征阻断电流的影响。在100 mV 电压下，Poly(dA)4-alkynyl的阻断程度I/I0值为0.38，而Poly(dA)5和Poly(dA)4的I/I0值分别为0.45和0.52，阻断程度递增0.07，即单个炔基侧链基团的引入对电阻断流程度的增强效果等同于增加1个腺嘌呤核苷酸。更重要的是，单个碱基修饰的Poly(dA)4-alkynyl分子的I/I0分布经高斯拟合后半峰宽较Poly(dA)5减小44%，而更集中的I/I0分布意味着纳米孔道对DNA分子具有更好的分辨能力。进一步统计分析显示，具有单个炔基侧链基团修饰的单个ssDNA在限域空间内的通过时间较未修饰ssDNA有效延长。因此，单碱基侧链的引入增强了Aerolysin纳米孔道对单个核酸分子电流的分辨能力，有望推动Aerolysin纳米孔在DNA直接测序及表观修饰检测中的应用。

该研究获得国家自然科学基金资助项目(21421004)和上海市“晨光计划”项目 (17CG27)资助。相关成果发表于《分析测试学报》2019年第2期129~133页。

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2019.02.001

【引用本文】路瑶，胡正利，应佚伦，龙亿涛. Aerolysin蛋白纳米孔道直接检测单个DNA碱基修饰[J].分析测试学报，2019，38(2): 129-133. 

【Cite this article】LUYao, HU Zheng-li, YING Yi-lun, LONG Yi-tao. Direct Single-moleculeDiscrimination of Acetylene-LinkedDeoxyribonucleoside Triphosphates with anAerolysin Nanopore. [J]. Journal of Instrumental Analysis, 2019, 38(2):129-133.

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