实时荧光定量pcr技术原理及技术研究

荧光定量PCR原理

通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

荧光定量PCR检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

实时荧光定量PCR服务内容

1.从动物细胞、人或动物组织等样品中提取核酸;

2.对核酸进行浓度及纯度分析;

3.荧光定量PCR检测;

(1)引物和探针的设计与合成;

(2)绝对定量和相对定量的选择;

(3)探针法和染料法的选择;

(4)荧光定量PCR仪对目的基因的检测;

(5)数据统计和分析;

4.预实验服务：根据客户提供的目的基因序列或NCBI序列号提供客户引物和探针，并筛选出优化的引物和探针;

5.正式实验服务：根据预实验筛选的引物和探针对所用样品进行荧光定量PCR的检测，并对结果进行统计和分析。

荧光定量PCR与普通PCR相比具有以下优点：

1.高灵敏性：可检测单个细胞基因;

2.高特异性和精确性：将DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精准性融合，应用荧光探针和光电传导，直接探测基因扩增过程中荧光信号的变化，以获得定量结果，相当于在PCR反应过程中自动完成了Northern杂交;

3.操作简便、速度快：通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化;

4.安全、无污染：FQ-PCR在全封闭状态下进行PCR扩增和产物分析，杜绝了传统PCR开放检测对环境的污染和由此导致的假阳性;

5.结果观测重复性好：一起在线实时观测，结果判断直观，避免人为因素干扰。

荧光定量PCR应用

实时荧光PCR技术已广泛应用于临床及生命科学研究的各个领域中。在科研方面可定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态SNP测定及易位基因的检测;在医疗方面可用于免疫组化分析、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微小残留病变研究等。