多管发酵法测水中总大肠菌群的方法

多管发酵法测水中总大肠菌群的方法

化工室：周琰

一、方法原理
  总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。主要包括有埃希式菌属、柠檬酸杆菌、肠杆菌属、等菌属的细菌。
二、标准溶液配制
  此方法无标准溶液
三、操作步骤
1、样品采集
  应采用在160～170℃灭菌2小时的玻璃瓶采样，采好的水样，应迅速送往实验室，进行总大肠菌群数检验。一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。若超过会引起水样污染，从而影响监测结果。
  若医院污水经过氯消毒应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
2、样品准备
  2.1、污水
    污水样品应至少取200mL，使用前应充分混匀。
    根据预计的污水样品中总大肠菌群数确定污水样品接种量。总大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10mL、1mL、0.1mL。总大肠菌群数较多时接种量为1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。
    接种量少于1mL时，水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为0.1mL、0.01mL时，取稀释比分别为1:10、1：100.其它接种量的稀释比依次类推。
1：10稀释样品的操作方法为：吸取1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1：10稀释样品。因此，取1mL1：10稀释样品，等于取0.1mL污水样品。其它稀释比的稀释样品同法制作。
  2.2初发酵试验
在5只装有5mL已灭菌的三倍乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL；在5只装有10mL已灭菌的单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样1mL；在5只装有10mL已灭菌的单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样1mL1：10稀释的水样。置于37℃培养箱培养24h。
2.3平板分离
经初发酵试验培养24h后，发酵管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为产气。将产酸产气及只产酸发酵管，分别接种于伊红美蓝培养基上，置于37℃培养箱培养18~24h。
2.4鉴定
    挑选可疑总大肠菌群菌落，进行革兰氏染色和镜检。可疑菌落有：1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；3）深紫红色，中心色较深的菌落。
    上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑选上述典型菌落1~3个接种于普通乳糖蛋白胨培养液中，置于 37℃恒温培养箱培养24h。
2.4计数
根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数，查表可得100mL污水中总大肠菌群MPN值，求出1L水中的总大肠菌群数
四、实际样品的测定
  医院污水中，不同程度的含有多种病毒、病菌、寄生虫卵和一些有毒有害物质，我国水污染防治法第二十条规定“排放含有病原体的污水必须经过消毒处理，符合国家有关标准后，方可排放”。二氧化氯被认为是一种安全高效强力杀菌剂，对水传播的病原微生物，包括病毒芽孢及水路系统中的异氧菌，硫酸盐还原菌和真菌等有很好的消毒效果。
  西安高新医院的污水执行《医疗机构水污染排放标准》具体限值见表一
      表一综合医疗机构和其它所有医疗机构污水污染物排放限制（日均值）

控制项目	排放标准
总大肠菌群数（个/L）	500个/L
pH	6-9
总余氯（mg/L）	3-10 mg/L  消毒接触池接触时间≥1h

2015年4月，对西安高新医院处理后排放污水中的总大肠菌群进行了监测。监测结果如下表：
              表二  总大肠菌群数测定

采样地点	西安高新医院			西安高新医院（平行样）			西安高新医院（平行样）
接种量及管数	10	1	0.1	10	1	0.1	10	1	0.1
	各5管			各5管			各5管
初发酵	4	2	1	5	1	0	4	2	1
平板分离	4	1	1	4	1	0	4	1	1
复发酵	4	1	1	4	1	0	4	1	1
MPN值	21			17			21
总大肠菌群数个/L	210			170			210

五、结论
  西安高新医院的污水总大肠菌群数为210，完全符合《医疗机构水污染排放标准》中的限值。
六、注意事项
1）采好的水样，应迅速送往实验室，进行总大肠菌群数检验。一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。
2）采样瓶必须提前灭菌，所使用的玻璃仪器都应高温灭菌。
3）革兰染色时要控制好每一步的时间。

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