食品中胡萝卜素的测定方法验证报告

食品中胡萝卜素的测定方法验证报告

GB 5009.83-2016

张霞

一、方法概述

1.范围
    本标准规定了食品中胡萝卜素的测定方法。
本标准色谱条件一适用于食品中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及总胡萝卜素的测定，色谱条件二适用于食品中β-胡萝卜素的测定。
2.原理
  试样经皂化使胡萝卜素释放为游离态，用石油醚萃取二氯甲烷定容，采用反相色谱法分离，外标法定量。
二、仪器与试剂
1. 仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
1.2 匀浆机。
1.3高速粉碎机。
1.4恒温振荡水浴箱：控温精度±1℃。
1.5旋转蒸发器。
1.6氮吹仪。
1.7紫外-可见光分光光度计。
以上仪器符合国标要求。
2. 试剂及其配制
  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
2.2木瓜蛋白酶：酶活力≥5U/mg。
2.3 氢氧化钾（KOH）。
2.4无水硫酸钠（Na₂SO₄）。
2.5 抗坏血酸（C₆H₈O₆）。
2.6石油醚：沸程30℃~60℃。
2.7甲醇（CH₄O)：色谱纯。
2.8三氯甲烷（CHCl₃）：色谱纯。
2.9甲基叔丁基醚[CH₃OC（CH₃）₃]：色谱纯。
2.10二氯甲烷（CH₂Cl₂）：色谱纯。
2.11无水乙醇（C₂H₆O）：优级纯。
2.12正己烷（C₆H₁₄）：色谱纯。
2.13 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（C₁₅H₂₄O，BHT）。
2.14氢氧化钾溶液：称固体氢氧化钾500g，加入500mL水溶解。临用前配制。
2.15β-胡萝卜素标准品    来源：上海安谱      货号：CDAA-281456
三、试样的制备
    谷物、豆类、坚果等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm~0.5mm）；蔬菜、水果、蛋、藻类等试样用均质器混匀；固体粉末状试样和液体试样用前振摇或搅拌混匀。4℃冰箱可保存1周。
四、分析步骤
1、标准曲线绘制
1.1 标准储备液（500.0μg/mL）:称取0.0500g（准确至0.0001g）β-胡萝卜素标准品于100mL容量瓶中，加入0.25gBHT，用二氯甲烷溶解，并定容至刻度。
1.2标准工作液的配制：
  分别吸取适量β-胡萝卜素标准溶液，用二氯甲烷定容至100mL容量瓶中，配制成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL系列工作液。
2、样品的处理
2.1普通食品试样
2.1.1预处理：蔬菜、水果、菌藻类、谷物、豆类、蛋类等普通食品试样准确称取混合均匀的试样1g~5g（精确至0.001g），油类准确称取0.2g~2g（精确至0.001g），转至250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸、75mL无水乙醇，于60℃±1℃水浴振荡30min。
    如果试样中蛋白质、淀粉含量较高（＞10%），先加入1g抗坏血酸、15mL45℃~50℃温水、0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶，盖上瓶塞混匀后，置55℃±1℃恒温水浴箱内振荡或超声处理30min后，再加入75mL无水乙醇，于60℃±1℃水浴振荡30min。
2.1.2皂化：加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，皂化30min。取出，静置，冷却到室温。
2.2添加β-胡萝卜素的食品试样
2.2.1预处理：固体试样，准确称取1g~5g（精确至0.001g），置于250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸，加50mL45℃~50℃温水混匀。加入0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶（无淀粉试样可以不加α-淀粉酶），盖上瓶塞，置55℃±1℃恒温水浴箱内振荡或超声处理30min。液体试样，准确称取5g~10g（精确至0.001g），置于250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸。
2.2.2皂化：取预处理后样品，加入75mL无水乙醇，摇匀，再加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，皂化30min。取出，静置，冷却到室温。
2.3试样萃取：将2.1.2或2.2.2中皂化液转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡10min后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法惊醒第二次提取。合并有机相，用水洗至近中性。弃水相，有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入500mL蒸发瓶中，于旋转蒸发器上40℃±2℃减压浓缩，近干。用氮气吹干，用移液管准确加入5.0mL二氯甲烷，盖上瓶塞，充分溶解提取物。经0.45μm膜过滤后，弃去初始约1mL滤液后收集至进样瓶中，备用。
3.仪器测定条件
3.1色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm或等效柱。
3.2流速：2.0mL/min。
3.3柱温：35℃±1℃。
3.4检测波长：450nm。
3.5进样量：20μL。
3.6流动相：三氯甲烷：乙腈：甲醇=3:12:85，含抗坏血酸0.4g/L，经0.45μm膜过滤后备用。
五、结果处理
试样β-胡萝卜素含量按下式进行计算：

X(μg/100g)=	C×V×100
	m

式中:X-试样中β-胡萝卜素含量,单位为微克每百克(μg/100g);
C-由标准曲线得到的待测液中β-胡萝卜素的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
m-试样质量,单位为克(g);
V-试样液定容体积,单位为毫升(mL)。
100—换算系数。
计算结果保留三位有效数字。
六、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
同时做空白实验。
β-胡萝卜素Y=8481.49*X+34.6455    R^2=0.9999677

以上结果表明β-胡萝卜素在0.5μg/mL～10μg/mL范围内，R^{^2}=0.9999677，β-胡萝卜素浓度和峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将1.00μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出β-胡萝卜素的方法检出限为0.5μg/100g，此检出限结果等于国标GB 5009.83-2016的方法检出限0.5μg/100g，故此方法满足条件。
七、方法精密度（重复性）
对LBF180700283样品分别进行6次加标重复性的测定，测定结果如下：

测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	5.0074	5.0051	5.0368	5.0109	5.0421	5.0247
浓度（μg/mL）	1.576	1.575	1.578	1.575	1.577	1.575
含量（μg/100g）	157	157	157	157	156	157
平均值（μg/100g）	157
RSD%	0.26

本方法的精密度为0.26%，符合GB 5009.83-2016中给出试样测试结果的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
八、准确度验证（加标回收）
对LBF180700283样品加标，取50.0μg/mL的标液0.075mL、0.12mL、0.22mL同样品同步处理后，结果见下表：

测定编号		β-胡萝卜素
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	β-胡萝卜素含量（μg/100g）	平均值      （μg/100g）	加标量 （μg/100g）	回收率%
1#	5.0429	5.0	0.835	82.79	82.9	/	/
2#	5.0560	5.0	0.839	82.97		/	/
加标1#	5.0361	5.0	1.554	154	154	74.5	95.4
加标2#	5.0285	5.0	2.018	201	201	119	99.2
加标3#	5.0284	5.0	2.999	298	298	219	98.2

    由上表可以看出β-胡萝卜素测定的加标回收范围在 80%-110% ，RSD值为2.02%符合规定要求。
九、总结
从检出限、线性范围、重复性、回收率测试结果可知，均符合方法要求，本实验方法符合GB 5009.83-2016的要求。

维权声明：本文为T130554原创作品，本作者与（仪器信息网/我要测网）是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。