一点红抗炎活性部位HPLC指纹图谱的研究

一点红抗炎活性部位HPLC指纹图谱的研究

西安国联质量检测技术股份有限公司

食品事业部：石珊

1 仪器与药品
  岛津LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-20A紫外检测器、Inertsil ODS-SP C18柱）；BILON-1000Y超声波细胞粉碎机，上海比朗仪器制造有限公司；Infinite F50酶标仪，瑞士Tecan公司；
  乙腈，色谱纯；甲酸，分析纯；槲皮素(K1505114)、槲皮苷(A1526061)、木犀草素(C10016987)、咖啡酸(I1418166)、3,4-二羟基苯乙酸(A1513031)、对羟基苯乙酸（J1409049）、对羟基苯甲酸(B1505009)、HRP(K1506040)购于阿拉丁试剂（以上对照品纯度均≥98%，可作为分析标准品）；鼠李素、AA（均购自Quality Control Chemicals INC,批号分别为：10-0106/0、U-71A-S28-Z）；5-LOX（recomb ined human，购于cayman公司，Batch:0467742-1）；TMB-HCL西宝生物科技股份有限公司；一点红药材购自广西各大药房，样品信息具体见表1。
                表1    5批一点红药材信息

NO.	生产厂家	产地	生产批号
1	桂林兴安县鑫鑫中药饮片有限公司	广西桂林	141125
2	广西贵港市绿之源种养发展有限公司中药饮片厂	广西贵港	160601
3	广西柳州百草堂药业有限公司中药饮片厂	广西柳州	20151214
4	广西柳州百草堂药业有限公司中药饮片厂	广西柳州	20160301
5	广西柳州中药材市场	广西柳州	/

2 实验与方法
2.1一点红提取物的制备
  称取一点红粉末（过40目筛）10g，加100mL石油醚75℃ 提取2h，每小时收集滤渣。再加入100mL 70%乙醇溶液用超声波细胞粉碎机超声30min，过滤，滤渣加100 mL 70%乙醇溶解并回流4h，每2小时收集滤液，合并两次滤液，减压浓缩至无乙醇味，加水，依次用乙酸乙酯、正丁醇反复萃取，旋蒸、干燥，备用。
2.2 一点红提取物抗5-LOX活性
2.2.1实验原理
    花生四烯酸（AA）在5-LOX催化作用下生成5-羟基氧化物（5-HPETE），5-HPETE在HRP作用下使TMB氧化，产生蓝色阳离子根，加入终止剂H2SO4后，蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，在450nm波长处检测吸光度。
2.2.2 实验方法
Tris-HCL：0.1M pH=7.0；5-LOX：用前取10μL 原液（6.96mg/mL），缓冲液稀释，每孔用量10μL ，终浓度为1μg/孔；AA：（0.25mg/mL）配制成21mmol/L于-20℃下保存，临用时稀释，使其终浓度为100μmol/L；HRP：配制13.9mg/mL的储备液，于4℃冰箱保存，临时用稀释20倍。TMB：配制成7.4mg/mL储备液，避光保存，临用时稀释10倍；样品制备：将提取物溶于DMSO中，配制成含1mg/mL生药储备液。
①空白组：180μL Tris-HCL、10μL HRP
②对照组：170μL Tris-HCL、10μL 5-LOX、10μL HRP
③样品空白组：170μL Tris-HCL、10μL 药品、10μL HRP
④样品组：160μL Tris-HCL、10μL 5-LOX、10μL 药品、10μL HRP
    小心震荡酶标板使反应体系混匀，37℃避光孵育10min，依次加入10μL TMB、10μL AA以激活反应，15min，加入20μL  1M H2SO4终止反应，使用酶标仪450nm处测吸光度。
抑制率（%）=（△AE-△A）/△AE×100%
△AE-样品池中酶与底物反应后测定的吸光度（扣除相应背景空白）
△A -加入样品抑制剂后所测定的酶与底物反应的吸光度值（扣除相应背景空白）
2.3 一点红抗炎活性部位指纹图谱
色谱条件：流动相为1% 甲酸乙腈- 1% 甲酸水，梯度洗脱（梯度洗脱条件见表2），流速1mL/min，检测波长326nm，进样量20μL，记录色谱图65min。
                            表2 梯度洗脱条件

t/min                          1% 甲酸乙腈/%        1% 甲酸水/%
0	5	95
7	8	92
17	15	85
45	30	70
55	50	50
60	70	30
65	100	0

2.3.1 对照品溶液制备  准确称取各对照品适量溶于DMSO中，按照上述色谱条件依次测定，见图1. 按出峰时间依次为对羟基苯乙酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、槲皮苷、木犀草素、槲皮素、鼠李素。
2.3.2 供试品溶液制备  准确称取一点红乙酸乙酯、正丁醇部位10mg，DMSO溶解，配制成1mg/mL溶液。按上述色谱条件测定。
2.3.3 精密度试验    取同一供试品溶液连续进样6次，考察被确认共有峰的保留时间和峰面积。结果表明，各色谱峰的保留时间的RSD<1%，峰面积的RSD<3%。
2.3.4 稳定性试验    取同一供试品溶液，分别在0，3，6，9，12,24h进样检测，考察被确认共有峰的保留时间和峰面积。结果表明，各色谱峰的保留时间RSD<1%，峰面积RSD<3%。
2.3.5重复性试验    取同一供试品溶液5份，按上述方法制备和检测，考察被确认共有峰的保留时间和峰面积。结果表明，各色谱峰的保留时间RSD<1%，峰面积RSD<3%。
2.3.6供试品溶液的制备  准确称取5个批次的一点红粉末（过40目筛）5g，加50%甲醇100 mL超声（40HZ，200W）提取60min，过滤收集滤液定容至100 mL，用0.45μm微孔膜滤过，待用。
3结果
3.1 一点红提取部位抗5-LOX活性
  不同产地的一点红乙酸乙酯、正丁醇部位对5-LOX均有抑制作用。结果表明，一点红药材正丁醇提取部位抗5-LOX活性略高于乙酸乙酯部位。
                      表3为一点红不同活性部位抗5-LOX 活性

厂家	乙酸乙酯部位          正丁醇部位
洪才              60±0.1%                64±0.1%
绿之源            59.2±0.1%                65.6±0.1%
百草堂（1）        59.4±0.1%                65±0.1%
百草堂（2）        59±0.1%                65.2±0.1%
中药材市场        59.5±0.1%                64.6±0.1%

3.2一点红乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱与相似度分析
    分析一点红乙酸乙酯部位和正丁醇部位HPLC指纹图谱，发现乙酸乙酯部位图谱重现性、精密度、稳定性良好，且该部位化学信息较多。确定了该部位7个色谱峰，按保留时间先后顺序依次为：对羟基苯乙酸（21.7min）、咖啡酸（25.1min）、对羟基苯甲酸（25.6min）、槲皮苷（41.0min）、木犀草素（52.7min）、槲皮素（53.3min）、鼠李素（60.8min）。其中，4号槲皮苷含量最多，6号槲皮素次之，1号对羟基苯乙酸含量最少（见图1）。

                                            B

A 对照品HPLC图        B 乙酸乙酯部位HPLC图
1.对羟基苯乙酸 2.咖啡酸 3.对羟基苯甲酸 4.槲皮苷 5.木犀草素 6.槲皮素 7.鼠李素
  图1 一点红对照品混合溶液色谱图及其指纹图谱共有模式
3.2.2  5批一点红药材乙酸乙酯部位样品溶液测定
    对5个批次的一点红药材按上述方法提取得到乙酸乙酯部位并进行HPLC分析，得到5个批次一点红乙酸乙酯部位指纹图谱（见图2）。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行相似度评价，共标定了18个特征峰作为判别一点红抗炎部位质量的群体特征峰。不同来源一点红的HPLC乙酸乙酯部位指纹图谱相似度评价见表4。

            图2  5批一点红乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱
          表4        不同厂家一点红药材相似度评价结果

	1	2	3	4	5
厂家	洪才	绿之源	百草堂（1）	百草堂（2）	中药材市场
相似度	0.971	0.982	0.988	0.973	0.895

4.讨论
早期研究表明，一点红水提物和甲醇提取物与阿司匹林相比，对蛋清蛋白引起的小鼠足肿胀有较好的抑制作用。一点红甲醇提取物及二氯甲烷提取物可通过抑制炎性介质和细胞因子IL-1β、TNF-α细胞因子和NO来减轻炎症反应。一点红在临床上用于治疗静脉炎效果强于喜疗妥软膏，是治疗静脉炎的理想药物。本实验通过一点红乙酸乙酯部位对5-LOX的抑制，从而阻止5-LOX途径，减轻炎性症状。本实验对比了超声波细胞粉碎0min、60min、120min乙酸乙酯、正丁醇提取率，表明随着超声时间的延长，石油醚、乙酸乙酯部位提取率逐渐减小，正丁醇部位几乎无影响。可能由于细胞粉碎时间过长，导致糖类、粘液质等杂质的浸出，并附着于药材表面，影响乙醇的进入，从而影响石油醚、乙酸乙酯部位的提取率。考察乙醇加热回流2h、3h、4h，1h收集滤液以及回流4h，2h收集滤液。发现回流4h，2h收集滤液，各部位提取率最高。5-LOX体外抑制实验表明，一点红乙酸乙酯部位和正丁醇部位均具有良好的抗5-LOX活性，由于乙酸乙酯部位所含化学信息多，且谱图重现性、精密度、稳定性均良好。故建立了一点红乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱，标定了18个共有峰，确定了该部位7个色谱峰，按保留时间先后顺序依次为：对羟基苯乙酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、槲皮苷、木犀草素、槲皮素、鼠李素。

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