胶囊中总黄酮的测定方法验证

胶囊中总黄酮的测定方法验证

西安国联质量检测技术股份有限公司

食品事业部：肖颖

一、目的：对《保健食品检验与评价技术规范》（2003版)中总黄酮测定方法进行方法适用性验证。
二、验证内容：方法适用性验证包括检出限、线性范围、重复性、回收率、耐用性。
三、验证方法：
1  范围
    本标准适用于胶囊中总黄酮的含量测定。
2  原理
    试样中黄酮经乙醇提取，聚酰胺粉吸附，以苯除去杂质，用甲醇洗脱黄酮后，在360nm有最大吸收，其吸收值与黄酮量在一定范围内成正比，与标准系列比较定量。
3  试剂和材料
3.1  试剂
实验室用水为双蒸馏水，所用试剂为分析纯级。
3.1.1 无水乙醇：分析纯。（来源：天津奥普升化工有限公司  批号：20161019)
3.1.2 芦丁标准溶液：（来源：上海金穗生物科技有限公司  批号：20161027)
称取5.0芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL。
3.1.3 甲醇（来源：天津市天力化学试剂有限公司  批号：20150408 ）
3.1.4 聚酰胺粉（来源：浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂  批号：201600409 ）
3.1.5 苯（来源：天津市科密欧化学试剂有限公司  批号：20140510 ）
以上试剂符合检测要求
4  仪器和设备
4.1超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司 型号：KQ5200B
4.2电子天平：沈阳龙腾电子有限公司 型号：JM-B10002 精度：0.0001g
4.3分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司 型号：TU-1901或同等程度仪器
  以上仪器符合检测要求
5  波长选择专属性实验
取芦丁标准溶液（3.1.2）1.0mL加乙醇（3.1.1）定容至25mL，摇匀后，超声20min，吸取上清液1.0mL于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉（3.1.4）吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯（3.1.5）洗，苯液弃去，然后用甲醇（3.1.3）洗脱，定容至25mL，以甲醇（3.1.3）为参比，进行紫外可见光谱扫描，同时对样品空白进行扫描。
6  试样处理
样品提取：称取1.0g左右试样，加乙醇（3.1.1）溶解并定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，吸取上清液1.0mL于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉（3.1.4）吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯（3.1.5）洗，苯液弃去，然后用甲醇（3.1.3）洗脱黄酮，定容至25mL，为待测液。
7  测定：
标准曲线绘制：分别移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL芦丁标准溶液于10mL比色管中,加甲醇（3.1.3）至刻度,摇匀。用1cm石英比色皿在360nm处比色,测其吸光度。以吸光度为横坐标,总黄酮含量为纵坐标绘制校正曲线。
同时取待测液在360nm测定吸光度，计算试样中总黄酮含量。
8  公式
试样总黄酮含量按下式进行计算。

式中：
X—样品中总黄酮的含量，mg/100g；  A—样品测定液中黄酮的含量，μg；
m—样品质量，g；V₁-测定用样品液体积，mL；V₂-试样定容体积，mL。
计算结果保留二位有效数字。
四、验证数据
1.波长选择
经过全波长扫描，芦丁标准溶液在360nm处有最大吸收峰，且试剂空白和样品空白在此波长处无干扰，故选择360nm为最佳测定波长。

2.线性范围
以总黄酮含量（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：A=0.0029C-0.0069  R²为0.999。

总黄酮含量(μg)	0	52	104	156	208	260
A	0	0.133	0.284	0.445	0.598	0.730

以上结果表明总黄酮在0-260μg范围内，吸光值与总黄酮含量线性良好，符合要求。
3. 检出限
以甲醇（3.1.3）为参比，同时在360nm处对标准曲线0管进行20次测定，计算标准偏差，以3倍标准偏差值与斜率的比值为最低检出含量，利用公式计算出检出限。
经测定，标准偏差为0.000366，最低检出含量为0.379μg，检出限为1.0mg/100g，满足胶囊中对检出浓度的要求。
4.重复性
称取6份试样按照上述处理方法进行试样处理，分别吸取适量样液进行比色，求得样液中总黄酮含量。

测定编号	1	2	3	4	5	6
样品含量mg/100g	323.1	318.9	320.2	326.1	324.6	322.7
平均值mg/100g	322.6
相对标准偏差%	0.831

由上表可知，试样中总黄酮测定的重复性均值为322.6，RSD值为0.831%，符合规定。
5.回收率
在进行重复性试验基础上，同时进行加标试验，加标量分别为1.2倍，1.0倍，0.8倍，结果见下表：

测定编号	1	2	3	4	5	6
样品含量mg/100g	323.1	318.9	320.2	326.1	324.6	322.7
加标量mg/100g	347.30	354.98	304.81	309.28	251.82	258.99
加标样品含量mg/100g	651.22	659.02	630.58	649.8	549.98	567.79
加标回收率%	94.48	95.81	101.83	104.66	89.50	94.63

由上表可以看出胶囊中总黄酮测定的加标回收范围在80%-120%，符合规定。
6.耐用性
同时进行人员比对和仪器比对检测胶囊中总黄酮，结果见下表。

编号	人员1	人员2	仪器1	仪器2
样品含量mg/100g	322.8	325.7	322.1	323.7
相对误差%	0.89		0.50

由上表可知，胶囊中总黄酮测定耐用性符合要求
综上所述：从波长选择、检出限、线性范围、重复性、回收率、耐用性测试结果可知，均符合方法要求，本实验方法符合胶囊中总黄酮测定。

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